應(yīng)用案例（超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡-HS-AFM）：“眼見為實(shí)"HS-AFM實(shí)時(shí)成像粘連蛋白介導(dǎo)DNA環(huán)擠出的過程

翻譯整理：北京佰司特科技有限責(zé)任公司     

超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大學(xué) Prof. Ando 教授團(tuán)隊(duì)研發(fā)，日本RIBM公司（生體分子計(jì)測研究所株式會(huì)社，Research Institute of Biomolecule Metrology Co., Ltd）商業(yè)化的產(chǎn)品，可以達(dá)到視頻級(jí)成像的商業(yè)化原子力顯微鏡。HS-AFM突破了傳統(tǒng)原子力顯微鏡“掃描成像速慢"的限制，能夠在液體環(huán)境下超快速動(dòng)態(tài)成像，分辨率為納米水平。樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動(dòng)態(tài)觀測。超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡HS-AFM主要有兩種型號(hào)，SS-NEX樣品掃描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探針掃描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今，全球已有150多位用戶，發(fā)表 SCI 文章 300 余篇，包括Science, Nature, Cell 等頂級(jí)雜志。

相較于目前市場上的原子力顯微鏡成像設(shè)備，HS-AFM突破了 “掃描成像速慢"的限制，掃描速度高可達(dá) 20 frame/s，并且有 4 種掃描臺(tái)可供選擇。樣品無需特殊固定染色，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動(dòng)態(tài)觀測。液體環(huán)境下直接檢測，超快速動(dòng)態(tài)成像，分辨率為納米水平。探針小，適用于生物樣品；懸臂探針共振頻率高，彈簧系數(shù)小，避免了對(duì)生物樣品等的損傷。懸臂探針可自動(dòng)漂移校準(zhǔn)，適用于長時(shí)間觀測。采用動(dòng)態(tài)PID控制，高速掃描時(shí)仍可獲得清晰的圖像。XY軸分辨率2nm；Z軸分辨率0.5nm。

HS-AFM不僅擁有超高掃描速率與原子級(jí)別分辨率，而且具有操作的簡易性，使得對(duì)單分子動(dòng)態(tài)過程的捕捉變得十分方便，為科研工作者研所和理解生物物理、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、病毒學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的單分子動(dòng)態(tài)過程提供了一款強(qiáng)大的工具。

全新的HS-AFM采用了新的高頻微懸臂架構(gòu)，更低噪音、更高穩(wěn)定性的2控制器，高速掃描器，緩沖防震設(shè)計(jì)，主動(dòng)阻尼，動(dòng)態(tài)PID，驅(qū)動(dòng)算法優(yōu)化，多種前沿技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)在超高速下獲取高分辨的生物樣品信息。新系統(tǒng)整合了基于工作流程的操作軟件，直觀的用戶界面與流程化、自動(dòng)化的設(shè)置使得研究人員可以專注于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，不需要復(fù)雜的操作和條件設(shè)置，快速獲取數(shù)據(jù)，加速研究的產(chǎn)出。

Cohesin mediates DNA loop extrusion by a “swing and clamp" mechanism

CELL. VOLUME 184, ISSUE 21, P5448-5464.E22, OCTOBER 14, 2021

基因組DNA折疊形成環(huán)狀以及拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域（Topologically associating domains，TADs），從而組成了基因組復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，這些三維結(jié)構(gòu)具有重要的結(jié)構(gòu)和調(diào)控作用。先前的研究已經(jīng)逐漸揭示出基因組結(jié)構(gòu)是由染色體結(jié)構(gòu)維持SMC（Structural maintenance of chromosomes）蛋白復(fù)合物所介導(dǎo)的環(huán)擠出（DNA loop extrusion）過程形成的（圖1）。單分子層面的研究表明SMC蛋白復(fù)合體和Cohesin蛋白的確能夠?qū)NA擠壓形成環(huán)狀。因此，關(guān)于基因組的三維結(jié)構(gòu)形成研究者們提出了“環(huán)擠出假說"，認(rèn)為染色體結(jié)構(gòu)維持的SMC復(fù)合物組織就基因組的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并通過環(huán)擠出來實(shí)現(xiàn)這一功能。但是這一過程的具體細(xì)節(jié)是如何進(jìn)行的還不得而知。

奧地利維也納生物中心 (VBC)分子病理學(xué)研究所Jan-Michael Peters研究組發(fā)現(xiàn)粘連蛋白通過“擺動(dòng)和鉗夾"機(jī)制介導(dǎo) DNA 環(huán)擠出。2021年10月7日出版的《細(xì)胞》雜志發(fā)表了這一成果。

他們分析了人類粘連蛋白-NIPBL 復(fù)合物如何介導(dǎo)環(huán)擠出，并使間期細(xì)胞中的染色質(zhì)折疊。 他們已經(jīng)確定了環(huán)擠出所需的 DNA 結(jié)合位點(diǎn)和大規(guī)模構(gòu)象變化，并確定了這些是如何協(xié)調(diào)的。他們的結(jié)果表明 DNA 通過自發(fā)的 50 nm 擺動(dòng)的粘連蛋白鉸鏈轉(zhuǎn)移，將 DNA 交給 SMC3 的 ATPase 頭部，在那里結(jié)合 ATP，然后DNA 被 NIPBL 夾住。

在這個(gè)過程中，NIPBL 從鉸鏈“跳躍"到 SMC3 頭部，從而可能將自發(fā)鉸鏈擺動(dòng)與 ATP 依賴性 DNA 夾緊結(jié)合起來。 這些結(jié)果揭示了粘連蛋白-NIPBL 和可能的其他染色體結(jié)構(gòu)維持 (SMC)復(fù)合物如何介導(dǎo)環(huán)擠出的機(jī)械原理。

該實(shí)驗(yàn)過程通過借助日本RIBM公司研發(fā)的超高速視頻原子力顯微鏡HS-AFM來完成，HS-AFM突破了傳統(tǒng)原子力顯微鏡“掃描成像速慢"的限制，能夠?qū)崿F(xiàn)在液體環(huán)境下超快速動(dòng)態(tài)成像，分辨率為納米水平。待測樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動(dòng)態(tài)觀測。

目前，一些體外的生化重構(gòu)實(shí)驗(yàn)一定程度上已經(jīng)證實(shí)了環(huán)擠出假說，這些結(jié)果證明SMC蛋白與Cohesin蛋白會(huì)以2.1kb/s的速度擠壓DNA，并且這一過程依賴于ATP酶活性（圖2）。但限于實(shí)驗(yàn)分辨率等問題，環(huán)擠出的過程是如何實(shí)現(xiàn)的具體細(xì)節(jié)還不得而知。

DNA環(huán)擠出過程中具體的構(gòu)象變化是如何發(fā)生的呢？為了揭開這一過程的全貌，作者們應(yīng)用了高速原子力顯微鏡（High-speed atomic force microscopy，HS-AFM）對(duì)Cohesin進(jìn)行了實(shí)時(shí)成像。

DNA環(huán)擠出“擺-夾"“Swing and clamp"模型

在ATP存在的情況下的，Cohesin三聚體復(fù)合物中會(huì)在環(huán)狀、桿狀以及彎曲狀構(gòu)象之間的變化。作者們發(fā)現(xiàn)DNA是通過Cohesin蛋白鉸鏈的彎曲進(jìn)而易位的，這樣將DNA轉(zhuǎn)移到SMC3的ATP酶活性頭部，在該位置與ATP結(jié)合，DNA被NIPBL夾住。在此過程中NIPBL從鉸鏈向SMC3頭部移動(dòng)，引發(fā)鉸鏈區(qū)域的自發(fā)擺動(dòng)以及ATP依賴的DNA結(jié)合，從而形成一個(gè)循環(huán)，使得DNA從鉸鏈延伸到SMC3的頭部，在此循環(huán)周期的末尾，DNA片段可以轉(zhuǎn)移到SMC1的頭部。由此，作者們提出了DNA環(huán)擠出的“擺-夾"“Swing and clamp"模型，這類似于抓娃娃機(jī)的小爪子，可以將通過鉸鏈的彎曲伸出機(jī)械手“抓住"DNA，然后上提，從而通過一次次循環(huán)促使DNA逐步環(huán)擠出。

Cohesin mediates DNA loop extrusion by a “swing and clamp" mechanism

Abstract: Structural maintenance of chromosomes (SMC) complexes organize genome topology in all kingdoms of life and have been proposed to perform this function by DNA loop extrusion. How this process works is unknown. Here, we have analyzed how loop extrusion is mediated by human cohesin-NIPBL complexes, which enable chromatin folding in interphase cells. We have identified DNA binding sites and large-scale conformational changes that are required for loop extrusion and have determined how these are coordinated. Our results suggest that DNA is translocated by a spontaneous 50 nm-swing of cohesin’s hinge, which hands DNA over to the ATPase head of SMC3, where upon binding of ATP, DNA is clamped by NIPBL. During this process, NIPBL “jumps ship" from the hinge toward the SMC3 head and might thereby couple the spontaneous hinge swing to ATP-dependent DNA clamping. These results reveal mechanistic principles of how cohesin-NIPBL and possibly other SMC complexes mediate loop extrusion.

作者通過超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡實(shí)時(shí)成像，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Cohesin促使的DNA環(huán)擠出過程的全紀(jì)錄，從而能夠?qū)NA從一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)帶到另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，揭開了SMC復(fù)合體進(jìn)行基因組的折疊的以及促進(jìn)復(fù)雜基因組三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)形成的機(jī)制。

這項(xiàng)工作的完成主要借助了日本RIBM公司研發(fā)的超高速視頻原子力顯微鏡HS-AFM，HS-AFM突破了傳統(tǒng)原子力顯微鏡“掃描成像速慢"的限制，能夠?qū)崿F(xiàn)在液體環(huán)境下超快速動(dòng)態(tài)成像，分辨率為納米水平。待測樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動(dòng)態(tài)觀測。推出至今，全球已有150多位用戶，發(fā)表SCI論文300余篇，其中包括Science, Nature, Cell 等頂級(jí)雜志。 

小結(jié)：使用HS-AFM獲得的高空間&時(shí)間分辨率的視頻圖像，可以準(zhǔn)確地反應(yīng)生物大分子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，用于定量研究。

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