PCR儀反應(yīng)體系異常狀況分析
點擊次數(shù)：1965 更新時間：2021-12-21
PCR儀擴增可設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（通常12種溫度梯度）。因為被擴增的不同的DNA段其適合的退火溫度不同，通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進行擴增，從而一次性PCR擴增就可以篩選出表達量高的適合退火溫度進行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣既節(jié)約時間，也節(jié)約經(jīng)費。在不設(shè)置梯度的情況下亦可當做普通的PCR用。正真的梯度，是每一排管都有準確的加熱控溫探頭。其他的都是從兩頭的熱傳遞來設(shè)計控溫，它多應(yīng)用于科研、教學機構(gòu)。
PCR儀的反應(yīng)體系出現(xiàn)異常狀況時的分析：
一、非特異性擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)
當擴增產(chǎn)物不止一種時,通常與以下幾種情況有關(guān)：
1.背景DNA與引物同源性高，可通過在兩個引物的內(nèi)側(cè)序列上再使用另一對擴增產(chǎn)物DNA再次進行PCR擴增；
2.退火溫度太低，引物和模板的配對是一個動態(tài)過程,分子的熱運動使引物與模板結(jié)合與解離而達到佳配對位點上，退火溫度太低,造成引物與模板的非特異性位點部分配對而解離不下來,這種不正確的配對,進入PCR反應(yīng)過程就可擴增出非特異性的產(chǎn)物DNA，提高退火的溫度將可改善結(jié)果；
3.過量的酶,Mg2+,引物和模板DNA可使PCR反應(yīng)造成混亂,強行擴增出非特異性產(chǎn)物DNA,適當降低這些試劑的量有助于問題的解決。
二、無特異性擴增產(chǎn)物帶
1.引物溶液反復(fù)凍融或污染了DNA酶類,造成引物降解；
2.模板DNA制備時模板已降解；
3.Taq酶有失活或有雜酶污染；
4.緩沖液條件不當；
5.引物不正確。
