什么是梯度PCR?

點(diǎn)擊次數(shù)：2327 更新時(shí)間：2021-05-31

對于一個(gè)PCR反應(yīng)，雖然有各種各樣的PCR儀引物設(shè)計(jì)軟件或者經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算最適的退火溫度，可是由于模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對于特殊片斷，經(jīng)驗(yàn)公式得到的數(shù)據(jù)不一定能"P"出來結(jié)果，細(xì)微的變化對結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題——在反應(yīng)過程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出適合的反應(yīng)條件。不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對于多種聚合酶混合酶擴(kuò)增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個(gè)非常重要，因?yàn)門aq和校正酶的最佳反應(yīng)溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。多次實(shí)驗(yàn)可在一臺儀器上完成，既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間提高效率，又節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。檢驗(yàn)地帶網(wǎng) 對于帶梯度功能的PCR儀，需要考慮梯度模式下不同梯度管排間的溫度均勻性和準(zhǔn)確性，還必須考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。這種差異可能導(dǎo)致在梯度模式下得出的最佳條件與標(biāo)準(zhǔn)模式下單獨(dú)做的結(jié)果出現(xiàn)差異。這一技術(shù)保證了在梯度模式和普通模式之間可以進(jìn)行可靠的信息傳遞，不會因?yàn)闇囟忍匦圆煌鴮?dǎo)致產(chǎn)量和特異性的變化。此外采用TCT（三組回路）技術(shù)的梯度PCR儀由于在梯度PCR模式下增加了一個(gè)加熱和冷卻的控制區(qū)域，保證了梯度溫度控制的精確性并使不同梯度管排間的溫度均勻性更好。在PCR儀上增加原位PCR模塊就可以在玻片上進(jìn)行原位PCR擴(kuò)增，MJ和eppendorf的PCR儀都有提供原位適配器以滿足不同需要。購買配有支持原位PCR模塊的PCR儀對從事醫(yī)學(xué)研究的工作者是很值得的，一機(jī)兩用。此外，隨著基因組高通量研究的需求的提高，各品牌都推出了多槽式高通量PCR儀，各有特長：MJ有一種一拖四，就是1個(gè)主機(jī)帶4個(gè)擴(kuò)增槽，每個(gè)槽可以獨(dú)立控溫，一次可以作96x4個(gè)樣品的PCR，不過一旦出現(xiàn)問題4個(gè)都不能用了。ABI則在原來的9700的基礎(chǔ)上推出了雙384孔的基座，一次完成384x2個(gè)樣品，使得9700的功能又?jǐn)U展到高通量領(lǐng)域而無需購買新的機(jī)器，可惜兩個(gè)384槽不能獨(dú)立控溫。

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